Блог

Дифференцированная опухоль кишечника


умеренно дифференцированная и низкодифференцированная аденокарцинома толстой кишки

Аденокарцинома толстой кишки — это злокачественная опухоль, развивающаяся из железистого эпителия. В структуре всех онкологических новообразований толстого кишечника она занимает первое место, на ее долю приходится до 95% раков данной локализации.

Причины развития аденокарциномы толстой кишки

Причины развития аденокарциномы до конца не ясны, но есть некоторые данные, позволяющие определить факторы риска, увеличивающие вероятность развития данной патологии:

  1. Характер питания — избыточное потребление животных жиров, высокобелковых продуктов и недостаток в рационе клетчатки, а также переедание, злоупотребление алкоголем.
  2. Наличие полипов толстого кишечника. В большинстве случаев аденокарциномы развиваются из уже имеющихся полипов, причем чем дольше он существует и больше его размер, тем выше риски малигнизации. Во многих странах людям старше определённого возраста (50 лет) рекомендуют проходить периодическую колоноскопию с одновременным удалением полипов. На сегодняшний день это наиболее эффективное средство профилактики.
  3. Генетическая предрасположенность. В большинстве случаев аденокарцинома толстой кишки является спорадическим заболеванием, т. е. не связана с наследственными факторами, но есть два случая, где генетика имеет ключевую роль. Это семейный аденоматозный полипоз и наследственный неполипозный рак толстого кишечника (он же синдром Линча).
  4. Наличие неспецифического язвенного колита и болезни Крона.
  5. Наличие в анамнезе рака женских половых органов.
  6. Иммунодефицитные состояния.

Классификация аденокарциномы толстой кишки

В зависимости от гистологического типа, выделяют следующие виды аденокарцином:

  • Тубулярная. Состоит из специфических трубчатых структур. Опухоль, как правило, имеет малые размеры и нечеткие границы.
  • Муцинозная. Характеризуется секрецией большого количества слизи. Во время гистологического исследования видно, что слизь занимает до половины объема злокачественных клеток. Опухоль относится к низкодифференцированным формам аденокарциномы, характеризуется быстрым ростом и ранним метастазированием.
  • Перстневидноклеточная. Также относится к высокой степени злокачественности, на момент постановки диагноза, как правило, обнаруживаются отдаленные метастазы. Чаще диагностируется у молодых людей.

В зависимости от степени зрелости опухолевых клеток, аденокарциномы делят на следующие типы:

  • Высокодифференцированная аденокарцинома. Характеризуется относительно «нормальным» строением клеток, в которых отмечается увеличение размеров ядер. Клеточные функции сохранены. Опухоль характеризуется относительно благоприятным прогнозом, поскольку растет медленно. Но в то же время ее тяжело диагностировать на ранних стадиях, поскольку внешне клетки сходны с нормальной тканью.
  • Умереннодифференцированная аденокарцинома характеризуется более неблагоприятным прогнозом. Клетки полиморфны, склонны к быстрому делению и, как следствие, быстрому росту опухоли.
  • Низкодифференцированная и недифференцированная аденокарцинома наиболее неблагоприятны. Клетки отличаются высоким полиморфизмом, опухоль не имеет четких границ, инфильтрирует (прорастает) кишечную стенку и характеризуется быстрым агрессивным ростом и ранним метастазированием.

В зависимости от распространенности опухолевого процесса выделяют следующие стадии аденокарциномы:

  • 1 стадия — раковые клетки обнаруживаются только в слизистой оболочке кишечной стенки.
  • 2 стадия — опухоль прорастает все слои стенки кишки.
  • 3 стадия — рак дает метастазы в регионарные лимфатические узлы.
  • 4 стадия — обнаруживаются отдаленные метастазы, которые поражают внутренние органы.

Симптомы аденокарицномы толстой кишки

Аденокарцинома толстой кишки долгое время никак себя не проявляет. Первые симптомы могут появиться, когда опухоль достигает больших размеров и затрагивает другие органы. В ряде случаев имеются косвенные признаки наличия злокачественных новообразований:

  • Необъяснимое снижение веса.
  • Потеря аппетита.
  • Упадок сил.
  • Анемия, которая развивается на фоне скрытого кровотечения из опухоли.

Симптоматику определяет и место локализации аденокарциномы. Если опухоль расположена в правом отделе ободочной кишки, то, как правило, из первых симптомов наблюдаются явления диспепсии, связанные с нарушением работы соседних органов (желудок, поджелудочная железа, печень и желчный пузырь). Возможны скрытые кровотечения, на фоне которых развивается анемия и слабость. Поскольку в этом месте кишка имеет широкий просвет и жидкое содержимое, обтурация (закупорка просвета) развивается только на последних стадиях и то, не во всех случаях. Если опухоль имеет большие размеры, ее можно прощупать через стенку живота.

Левый отдел ободочной кишки имеет меньший диаметр, а кишечное содержимое более плотную консистенцию, поэтому опухоли данной локализации чаще проявляются явлениями кишечной непроходимости. Застой кишечного содержимого приводит к усилению процессов гниения и брожения, что вызывается вздутие живота и коликообразные боли. На смену запору приходит диарея со зловонным стулом. В ряде случаев кале могут обнаруживаться примеси крови.

Обследование при аденокарциномах толстого кишечника

Золотым стандартом обнаружения аденокарциномы толстой кишки на ранней стадии является тотальная колоноскопия. Специалисты Европейской онкологической клиники рекомендуют ее делать всем людям старше 50 лет раз в десятилетие. Это позволит предотвратить озлокачествление существующих доброкачественных полипов. Данный метод доставляет пациентам определенный дискомфорт, поэтому зачастую выполняется под внутривенным наркозом. Стоимость такого обследования довольно высока, к тому же оно требует специальной подготовки.

Далеко не всегда пациенты готовы к данной процедуре, поэтому есть более простой и доступный вариант, хотя и менее точный — исследование кала на скрытую кровь. Если результат анализа оказывается положительным, пациента направляют на тотальную колоноскопию.

Диагностика аденокарцином толстой кишки

Диагноз аденокарцинома толстой кишки выставляется только на основании гистологического заключения — исследования кусочка опухолевой ткани под микроскопом. Процесс изъятия фрагмента ткани называется биопсия, ее проводят с помощью эндоскопической техники во время проведения колоноскопии. Если диагноз подтверждается, назначается дальнейшее обследование, которое направлено на определение гистологического типа опухоли, ее молекулярно-генетических особенностей. Также проводится комплексное обследование, направленное на установление степени распространенности злокачественного новообразования. С этой целью проводится КТ, МРТ, УЗИ. Все вместе это позволит выбрать оптимальную тактику лечения. Также назначаются анализы на онкомаркеры: РЭА, СА19-9, СА-72-4. Они хоть и не помогают в обнаружении опухоли как таковой, но отслеживание динамики их концентрации позволяет оценить эффективность дальнейшего лечения и вовремя определить рецидив заболевания.

Лечение аденокарциномы толстой кишки

Для лечения аденокарциномы применяют хирургические операции и химиотерапию. При расположении опухоли в прямой кишке возможна лучевая терапия.

Хирургическое лечение

Хирургическое лечение предполагает удаление аденокарциномы в пределах здоровых тканей кишки. В зависимости от объема удаляемого кишечника выделяют следующие виды операции:

  • Резекция толстой кишки. Иссекается опухоль в пределах здоровых тканей. Концы сшиваются, образуя анастомоз.
  • Гемиколэктомия. Удаляется половина толстого кишечника. Соответственно, выделяют правостороннюю и левостороннюю гемиколэктомию.
  • Колэктомия — удаляется вся толстая кишка.

Если опухоль проросла на соседние органы, выполняется комбинированная операция с удалением всех пораженных тканей единым блоком с соблюдением правил абластики. Как правило, это обширные травматичные вмешательства.

Отдаленные одиночные метастазы (в печени, легких, яичниках) также удаляются оперативным путем, единовременно с основной опухолью или отдельной операцией, которая проводится через несколько недель. Этот вопрос решается консилиумом.

В ряде случаев после удаления аденокарциномы не удается наложить анастомоз, тогда вышележащий отдел кишки выводят на брюшную стенку, это называется колостомой. Она может быть временной или постоянной. В первом случае через некоторое время после удаления опухоли проводят реконструктивные вмешательства, восстанавливающие целостность кишечника.

Альтернативой колостоме может стать эндоскопическое стентирование — установка специальной конструкции, поддерживающей просвет кишки в месте поражения опухолью в расправленном состоянии. Его могут выполнять в двух вариантах:

  • Предоперационная декомпрессия. Она позволяет подготовить пациента к одномоментной операции без наложения колостомы. Расправление кишки устраняет явления кишечной непроходимости, нормализует водно-электролитный баланс и подготавливает кишечную стенку к наложению анастомоза. Кроме того, стентирование дает время для проведения адьювантной химиотерапии, что позволит уменьшить размер опухоли и провести операцию, не удаляя большой объем кишки.
  • Паллиативное лечение — эндоскопическое стентирование может стать альтернативой постоянной колостоме или наложению обходного анастомоза для пациентов, которым по каким-либо причинам невозможно провести хирургическое вмешательство.

Химиотерапия

Химиотерапия при аденокарциномах толстой кишки проводится в двух режимах:

  1. Неоадъювантный, который назначается на дооперационном этапе. Его целью является уменьшение размеров опухоли, что позволяет легче удалить ее во время хирургического вмешательства. Неоадъювантная терапия в некоторых случаях позволяет перевести опухоль из нерезектабельного состояния в резектабельное и провести операцию, которая изначально была невозможна.
  2. Адъювантный режим предполагает применение химиопрепаратов в послеоперационном периоде. Его целью является уничтожение оставшихся раковых клеток и предотвращение развития рецидивов заболевания.

Для химиотерапевтического лечения аденокарциномы имеется несколько протоколов, все они включают цитостатики на основе фторпиримидинов.

Также может использоваться и таргетная терапия, которая действует на молекулярные механизмы, обеспечивающие опухолевый рост. Используются препараты, подавляющие действие фактора роста эндотелия сосудов (бевацизумаб, рамуцирумаб) или блокаторы рецептора эпидермального фактора роста (цетуксимаб). Их назначение происходит в соответствии с молекулярно-генетическим тестированием.

Лучевая терапия

Лучевая терапия используется только при лечении аденокарцином прямой кишки, поскольку остальные отделы толстого кишечника обладают высокой подвижностью, что не позволяет произвести разметку поля облучения. Лучевая терапия может использоваться на дооперационном и послеоперационном этапе. В первом случае преследуется цель уменьшения опухолевой массы, а во втором — уничтожение раковых клеток в окружающих тканях.

Иммунотерапия аденокарциномы при наличии микросателлитной нестабильности

Около 15% случаев аденом толстой кишки развивается в результате поломки системы восстановления ошибочно спаренных нуклеотидов — особой системы, которая призвана своевременно распознавать и устранять мутации ДНК. Если она не работает, генетический код не защищен и клетки активно накапливают мутации, которые выявляются в повторяющихся нуклеотидных последовательностях — микросателлитах. Такое состояние называется микросателлитной нестабильностью. Опухоли, имеющие данную особенность, хорошо отвечают на иммунотерапию.

В норме иммунная система должна уничтожать чужеродные клетки и агенты, но раковой опухоли удается избежать этого процесса с помощью особых процессов взаимодействия с иммунитетом. Иммунотерапия блокирует эти процессы и делает опухоль заметной мишенью, что позволяет уничтожить ее. За разработку данного метода лечения в 2018 году была вручена Нобелевская премия.

Одним из иммунологических препаратов является пембролизумаб. Его назначение позволяет значительно улучшить результаты лечения пациентов с метастатической формой аденокарциномы толстой кишки, характеризующейся микросателлитной нестабильностью.

Метастазирование аденокарциномы

Метастазирование аденокарциномы осуществляется несколькими способами:

  1. Лимфогенный — с током лимфы опухолевые клетки сначала попадают в регионарные лимфатические узлы, а оттуда в более отдаленные группы, например, в надключичные.
  2. Гематогенный способ метастазирования предполагает рассеивание раковых клеток с током крови. Чаще всего образуются метастазы в печени (по воротной вене) и легких. При низкодифференцированных и недифференцированных аденокарциномах возможно поражение костного мозга.
  3. Если аденокарцинома толстой кишки проросла окружающие органы, возможно имплантационное метастазирование в результате контакта опухоли с воспринимающей поверхностью. В этом случае возможны множественные метастазы по брюшине (канцероматоз).

Осложнения аденокарциномы толстой кишки

Осложнения аденокарциномы обычно развиваются на распространенных стадиях онкологического процесса, однако бывают случаи, что именно они и являются первыми признаками заболевания:

  1. Кишечная непроходимость. Она может быть компенсированная, субкомпенсированная и декомпенсированная. Декомпенсированная кишечная непроходимость (полная обтурация) наблюдается в конечных отделах толстой кишки, чаще всего на уровне сигмовидной или прямой кишки, поскольку в этих местах кишечный просвет уже, чем в выше расположенных отделах, а кишечное содержимое имеет плотную структуру. В любом случае кишечная непроходимость требует оперативного лечения. Раньше с этой целью накладывалась колостома — вышележащий отдел кишки выводится на живот. Сейчас же предпочтение отдается резекции участка кишечника вместе с опухолью, с наложением анастомоза. Если это невозможно, тогда уже прибегают к стомированию.
  2. Перфорация стенки кишки. Очень грозное осложнение, поскольку способствует выходу кишечного содержимого в брюшную полость или забрюшинное пространство с развитием тяжелейших перитонитов.
  3. Воспалительные процессы в опухоли. Чаще встречается перифокальное воспаление, реже внутриопухолевое. Воспаление связано с наличием в просвете кишки патогенной микрофлоры, которая инфицирует опухоль. Опасность таких процессов заключается в образовании инфильтратов, флегмон, абсцессов, а также перфорации кишечной стенки и развитием перитонита.
  4. Кровотечение. Хроническая кровопотеря приводит к развитию железодефицитной анемии и, как следствие, к снижению гемоглобина, общей слабости, головокружению. Клиническая картина будет определяться местом локализации опухоли. При выраженных кровотечениях опухоли вышележащих отделов наблюдается черный стул. Если кровоточит опухоль терминальных отделов толстого кишечника, в кале обнаруживаются алая кровь или ее сгустки. Многие пациенты принимают их за проявления геморроя.
  5. Прорастание опухоли в соседние органы, сопровождающееся нарушением их работы. Например, при прорастании опухоли в печень могут развиваться симптомы холецистита. Если аденокарцинома толстой кишки прорастает в полые органы, возникают свищи.

Прогноз

Главным образом, прогноз аденокарциномы зависит от гистологического типа опухоли и стадии заболевания на момент начала лечения. Наиболее благоприятная ситуация при начальных стадиях, когда еще нет регионарных и отдаленных метастазов. Пятилетняя выживаемость таких пациентов составляет 95% при первой стадии и 75% при второй стадии (учитываются все типы опухоли, даже самые злокачественные). Пятилетний рубеж при третьей стадии переживает только половина пациентов, при четвертой — около 5%.

Таким образом, чем скорее начато лечение, тем более благоприятный будет прогноз. Европейская онкологическая клиника проводит лечение аденокарциномы толстой кишки на всех стадиях заболевания, в том числе и в терминальных. Если излечение невозможно, мы направляем свои усилия на улучшение качества жизни пациентов.

,

[PDF] Глобальное профилирование микроРНК высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей тонкого кишечника

 @article {Li2013GlobalMP, title = {Глобальное профилирование микроРНК хорошо дифференцированных нейроэндокринных опухолей тонкой кишки}, автор = {Су-Чен Ли и Ахмед Эссагир, и К {\ 'силь Мартейн, и Рикардо В. Ллойд, и Жан-Батист Демулен, и Чель {\ "О }берг и Валерия Джандоменико}, journal = {Современная патология}, год = {2013}, объем = {26}, pages = {685 - 696} } 
Хорошо дифференцированные нейроэндокринные опухоли тонкого кишечника являются редкими злокачественными новообразованиями.Они возникают из энтерохромаффинных клеток, и очень мало известно о дифференциальной экспрессии микроРНК (миРНК). Целью этого исследования было определение профиля miRNA в хорошо дифференцированных нейроэндокринных опухолях тонкой кишки, которые могут играть решающую роль в развитии, прогрессии опухоли и потенциально в развитии miRNA в качестве новых клинических биомаркеров. Образцы из двух тестовых групп, 24 тонких кишечника… ПРОДОЛЖИТЬ ЧТЕНИЕ

Сохранить в библиотеке

Создать оповещение

Cite

Запустить Research Feed

.

Механизмы нацеливания на ось MDM2-p53-FOXM1 в хорошо дифференцированных нейроэндокринных опухолях кишечника

Перейти к основному содержанию MDC BerlinMDC Берлин

Основная навигация

Переключить основную навигацию Поиск
  • MDC
    • Меню
    • миссия
      • Миссия
      • Подход к исследованию
      • Истории успеха
      • Факты и цифры
      • Мы в MDC
      • Ответственное исследование
      • Опыт науки
      • История и происхождение
    • организация
      • Организация
      • руководство
      • администрация
      • Должностные лица и представители
      • Общество друзей
    • Гельмгольц
      • Гельмгольц
      • MDC в составе Helmholtz
      • Будущая тема: иммунология и воспаление
      • НАКО Исследование здоровья
    • кооперация
      • Сотрудничество
      • БиГ
      • DZHK
      • EU-LIFE
      • Продолжительность жизни
      • Дальнейшее сотрудничество
    • Расположение и кампус
      • Расположение и кампус
      • БиотехПарк Берлин-Бух
      • Информация для посетителей
      • Как добраться до Берлин-Бух
      • Как добраться до Берлин-Митте
    Просмотр MDC>
  • Исследовательская работа
    • Меню
    • Области исследований
      • Области исследований
      • Исследования рака
      • Сердечно-сосудистые и метаболические заболевания
      • Заболевания нервной системы
      • Медицинская системная биология (BIMSB)
      • Клинические исследования
      • Сфера деятельности: наука о данных
    • Лаборатории и сотрудники
      • Лаборатории и сотрудники
      • Исследовательские лаборатории
      • ребята
    • Научная инфраструктура
      • Научная инфраструктура
      • Технологические платформы
      • Передача технологии
      • Службы поддержки
      • Объекты для животных
    • Публикации
      • Публикации
      • Основные результаты исследований
      • Научные публикации
      • База данных публикаций
      • Редакции
      • Исследовательский отчет
    • Научные мероприятия
      • Научные мероприятия
      • Семинары и лекции
    Просмотреть исследование>
  • Карьера
.

Обзор - Органоиды кишечника - Органоиды - Области интересов

Органоиды кишечника

Культуры органоидов кишечника - это трехмерные (3D) модели ткани in vitro, которые включают многие физиологически важные особенности ткани кишечника in vivo. Эти особенности включают поляризованный эпителиальный слой, окружающий функциональный просвет, и все типы клеток кишечного эпителия, присутствующие в пропорциях и относительном пространственном расположении, которые повторяют то, что наблюдается in vivo.

В течение последнего десятилетия произошел резкий сдвиг в доступности инструментов и модельных систем, используемых для изучения кишечного эпителия, с развитием и внедрением кишечных органоидных культур, занимающих центральное место в этом движении. С момента появления модели органоидов тонкого кишечника мышей в 2009 г., –1, в этой области произошел лавинообразный рост, в том числе создание условий культивирования органоидов человека, полученных из первичной ткани толстой кишки, 2 , а также плюрипотентной ткани человека. стволовые клетки (чПСК). 3 Различные экспериментальные методики также были разработаны параллельно и применены к культурам кишечных органоидов с синергетическим с научной точки зрения эффектом. Некоторые из этих методов включают новые инструменты для генетической манипуляции, 4,5 подходы к моделированию заболеваний in vitro 6–9 и инновационную систему совместного культивирования с аутологичными типами клеток 10,11 или бактериями, 12–14 а также модели вирусных инфекций. 15,16 Развитие таких методов применительно к культурам кишечных органоидов значительно увеличило полезность этой модельной системы для самых разных целей.В то время как большая часть первоначальной основы для системы культивирования органоидов изначально возникла из глубоких корней в биологии развития, система моделей созревания теперь применяется в самых разных областях исследований, включая открытие новых лекарств и скрининг лекарств для конкретных пациентов, рак и иммунологию. исследования и патогенез инфекционных агентов. Число исследователей, применяющих системы культивирования кишечных органоидов для обогащения своих конкретных исследовательских программ, быстро растет как в фундаментальных исследованиях, так и в медицинских сообществах.

Эпителий кишечника

Кишечный эпителий включает несколько различных популяций клеток, включая быстро делящиеся кишечные стволовые клетки (ISC), которые облегчают типичный четырех-пятидневный цикл обновления кишечного эпителия взрослых. 17 Это свойство быстрой регенерации при кишечном застое делает кишечник уникально удобной модельной системой для биологии эпителиальных клеток и биологии взрослых стволовых клеток как внутри, так и за пределами специфического контекста функции кишечника.

Эпителий кишечника взрослого человека в основном состоит из шести типов клеток, которые расположены в структуре крипта-ворсинка 18 (Рисунок 1). В основании кишечной крипты ISCs обнаруживаются интеркалированными с клетками Панета, 17 , которым приписывают большую часть передачи сигналов, необходимых для поддержания ниши ISC. Транзитные амплифицирующие клетки представляют собой частично дифференцированные клетки, которые мигрируют вверх посредством физического механизма исключения крипт, когда ISC под ними делятся.По мере того как эти клетки движутся вверх из крипты, они перемещаются по сигнальным градиентам, которые запускают их дифференцировку, давая начало зрелым типам клеток, которые населяют домен ворсинок. Зрелые клетки включают энтероциты, которые составляют большую часть эпителия ворсинок и осуществляют всасывание питательных веществ; бокаловидные клетки, которые выделяют слизь для защиты эпителиальной выстилки и помогают перемещать кишечное содержимое через просвет; и энтероэндокринные клетки, которые реагируют на химические механизмы содержимого просвета, секретируя гормоны в организм для поддержания метаболизма питательных веществ.

Рис. 1. Схема эпителия тонкой кишки, подчеркивающая идентичность и пространственное расположение ключевых типов эпителиальных клеток.

Стволовые клетки LGR5 + сохраняют свою способность к самообновлению и регенерации кишечного эпителия в первую очередь благодаря своему положению в нише стволовых клеток. 2 Кишечная ниша хорошо охарактеризована и, как было показано, состоит из пространственных градиентов высокого WNT и фактора роста эпителия (EGF), в то время как сигналы костного морфогенетического белка (BMP) подавлены.Понимание этих ниш сигнализирует о развитии условий культивирования органоидов кишечника.

Типы органоидов кишечника

Органоиды, полученные из первичных тканей кишечника

Основополагающая работа по системе культивирования органоидов кишечника, вышедшая из лаборатории Ханса Клеверса в 2009 г. -1 , описывает систему культивирования, в которой ниша стволовых клеток взрослых кишечных стволовых клеток воспроизводится in vitro.Это позволяет создать органотипические культуры эпителиальных клеток кишечника, которые поддерживают регенеративные свойства кишечника in vivo. Эти кишечные органоиды, иногда называемые энтероидами, размножаются из эпителиальных кишечных стволовых клеток, которые существуют во взрослой кишечной ткани, и как таковые образуют изолированную эпителиальную структуру в культуре. Эта модель позволяет исследовать эпителиальную систему кишечника и напрямую манипулировать передачей сигналов в нишах стволовых клеток без мешающего влияния ассоциированной мезенхимы.

Первый протокол, опубликованный Sato et al. –1 описали выделение интактных кишечных крипт из кишечной ткани мыши и их последующее культивирование с образованием органоидов. Кишечные крипты встроены в купол внеклеточного матрикса Matrigel ® и погружены в питательную среду, содержащую специфические факторы роста, предназначенные для имитации передачи сигналов, присутствующих в основании кишечных крипт in vivo. Эта работа продемонстрировала, что создание кишечных органоидов возможно из отдельных отсортированных LGR5 + кишечных стволовых клеток, полученных в результате диссоциации кишечных крипт. 1 При культивировании с использованием этого метода органоиды образуют эпителиальный монослой, окружающий центральный просвет, а также зарождающиеся домены крипт, которые, как сообщается, содержат кишечные стволовые клетки и клетки Панета, составляющие их нишу. Как и в кишечном эпителии in vivo, клетки, составляющие органоидный эпителий, вытесняются и отслаиваются в просвет органоида. Это приводит к сбору клеточного мусора в просвете со временем и связанному с этим снижению жизнеспособности культур, даже в присутствии соответствующих факторов роста.Поэтому органоидные культуры периодически пассируют, отделяя органоиды от Matrigel ® и разбивая их на фрагменты, которые пересеивают в новые культуры. Этот процесс может повторяться бесконечно с замечательной генетической стабильностью, 19 , и представляет собой эффективный метод размножения популяции кишечных стволовых клеток.

После создания этой системы культивирования для тонкого кишечника мышей она была адаптирована для создания органоидов из тонкой кишки человека, крипт толстой кишки человека и мыши и отдельных стволовых клеток кишечника. 2,20 Хотя органоиды, полученные из крипт кишечника и толстой кишки, имеют много общих характеристик, они также обнаруживают значительные различия. Они отражаются в клеточной динамике тканей in vivo, а также в ответе тканеспецифичных взрослых стволовых клеток на специфические концентрации сигнала ниши, присутствующие в среде для культивирования клеток. Как правило, в то время как культуры органоидов тонкого кишечника мышей имеют тенденцию обнаруживать обширное почкование криптоподобных доменов, органоиды толстой кишки, происходящие из крипт как мыши, так и человека, имеют тенденцию демонстрировать более кистоподобную морфологию со значительно менее выраженным почкованием или отсутствием почкования.Точно так же существует повышенная потребность в передаче сигналов WNT при культивировании органоидов человека по сравнению с мышами. 2 Это вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток и приводит к более кистозному фенотипу для культур органоидов кишечника человека по сравнению с соответствующими органоидами мыши.

Было много улучшений и модификаций базовой методологии культивирования, впервые разработанной для органоидов кишечного эпителия мыши и человека. Эти последующие исследования представили методологии для специальной адаптации системы культивирования для тканей пациентов, полученных из опухоли, с различными зависимостями от факторов роста 21,22 ; выращивание органоидов в форматах, подходящих для скрининга соединений со средней и высокой пропускной способностью 23,24 ; и использование определенных систем внеклеточного матрикса, 25 среди других приспособлений для конкретных приложений.

Органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток

Вскоре после внедрения системы культивирования органоидов, полученных из стволовых клеток кишечника, была опубликована методология культивирования органоидов кишечника человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в которой использовалась большая часть той же методологии для 3D-культуры органоидов. 3 В отличие от органоидов кишечного эпителия, выращенных из изолированных крипт или LGR5 + кишечных стволовых клеток, кишечные органоиды, полученные из дифференцированных hPSC, включают мезенхимный компартмент, который способствует передаче сигналов ниш кишечных стволовых клеток, присутствующих в культурах. 18 Органоиды кишечника, полученные в результате направленной дифференцировки hPSCs, также обладают характеристиками, напоминающими долгосрочные процессы, происходящие во время нормального развития тканей; на ранних пассажах органоиды характеризуются четко выраженным фетальным кишечным фенотипом, тогда как полное созревание кишечных эпителиальных клеток до сих пор возможно только путем трансплантации органоидов в капсулы почек мыши. 26 Повторение развития кишечника в органоидной системе, полученной из hPSC, делает эту модель отличным инструментом in vitro для исследования этапов развития кишечника в экспериментальной системе, которой легко манипулировать. 18 Кроме того, эта система позволяет получать органоиды от отдельных пациентов без необходимости биопсии кишечника или толстой кишки, что делает ее полезным инструментом для исследования фенотипических свойств кишечного эпителия людей с широким спектром генетических характеристик.

Протокол создания кишечных органоидов из недифференцированных клеток включает дифференцировку hPSCs в дефинитивную энтодерму и инициирование спецификации средней / задней кишки в виде монослойной культуры посредством индукции судьбы кишечника в 3D-культуре в виде кишечных органоидов. 3 Интересно, что формирование 3D-культур происходит в этих культурах спонтанно в ходе направленной дифференцировки в заднюю кишку; сфероиды, демонстрирующие маркеры задней кишки, выходят из монослойных культур и могут быть легко выделены из супернатантов культур. Подобно органоидам первичного тканевого происхождения, частично дифференцированные сфероиды затем внедряются в купола Matrigel ® и инкубируются в среде для культивирования клеток, которая способствует их дифференцировке в кишечную ветвь и последующее частичное созревание. 3

Экспериментальные методы, применяемые к органоидным культурам

Широкое распространение и применение культур органоидов кишечника в различных областях в значительной степени связано с множеством экспериментальных инструментов и подходов, которым эти культуры поддаются. С момента внедрения базовой методологии культивирования органоидов было много достижений как в разработке, так и в проверке различных методов в системе моделей кишечных органоидов.

Генетическая манипуляция

Ключевой функцией кишечной органоидной системы является способность манипулировать генетической идентичностью клеток, составляющих культуру, особенно в сравнении с проблемами или невозможностью подобных манипуляций, выполняемых в моделях in vivo. Культурами кишечных органоидов можно манипулировать генетически с помощью различных средств, включая введение генетического материала через ретро-, адено- и лентивирусную инфекцию 27–29 или электропорацию, 30 , а также специфический сайт-направленный мутагенез с использованием CRISPR Техника редактирования гена Cas9. 31 После применения определенной техники генетической модификации культуры органоидов могут быть восстановлены клонально из одноклеточных суспензий отсортированных стволовых клеток 1,2 или целых диссоциированных органоидов, что позволяет изолировать желаемый генетический вариант для дальнейшего размножения в 3D культура. Для модели кишечника мышей это дает значительное преимущество по времени и энергии, необходимым для создания особой линии мышей с нокаутом. Для модели кишечника человека способность манипулировать генетическим составом клеток in vitro дает возможность осуществлять такой уровень контроля над генетическим составом модели, который в противном случае был бы невозможен с использованием традиционных методов первичной клеточной культуры или иммортализованных клеточных линий. ,

В дополнение к их совместимости с прямой генетической манипуляцией in vitro, культуры органоидов также являются высокоинформативным способом изучения ранее существовавших нокаутных моделей для исследования механизмов конкретных клеточных процессов или патологий болезней.

Биобанки

Культуры кишечных органоидов обладают высокой проходимостью, сохраняя при этом замечательный уровень генетической и фенотипической стабильности. 32 Однако иногда бывает выгодно создать статическую библиотеку органоидных культур путем криоконсервации культур. Это особенно верно в контексте создания криоконсервированных библиотек органоидов, полученных от пациентов, которые сохраняют свойства исходной культуры и могут использоваться в таких приложениях, как доклинический скрининг эффективности лекарств. 23 Оттаявшие клетки обычно имеют короткий период восстановления (от одного до двух пассажей), в течение которого они демонстрируют сниженную скорость роста, а после этого они возобновляют динамику роста до замораживания.

Системы совместного выращивания

Возможность изучать взаимодействие эпителиальных клеток, которые образуют основу системы культивирования органоидов кишечника, с другими специфическими типами клеток, которые могут быть введены в систему культивирования, составляет еще одно существенное преимущество системы модельных органоидов. Выделение эпителия (или эпителия с ассоциированной мезенхимой в случае органоидов, происходящих от hPSC) от других систем организма в системе органоидной культуры представляет собой преимущество с точки зрения экспериментальной специфичности, но также и ограничение в отношении исследования специфических взаимодействий между этим эпителием и другие аутологичные или чужеродные клетки.Этот вопрос решается путем постоянного развития новых систем совместного культивирования органоидов кишечника с различными другими типами клеток. Органоиды кишечника культивировали с иммунными клетками 10,11,33 путем введения неэпителиальных клеток во внеклеточный матрикс, поддерживающий культуру органоидов, таким образом повторяя взаимодействия, которые, как ожидается, будут иметь место на базолатеральной стороне эпителия. Функциональная кишечная нервная система также была создана посредством совместного культивирования органоидов, полученных из hPSC, и клеток нервного гребня, что позволило создать модель, позволяющую изучать нарушения моторики желудочно-кишечного тракта человека. 34 Точно так же живые бактерии были введены в просвет органоидных культур посредством микроинъекции для моделирования взаимодействий, которые происходят на апикальной стороне эпителия in vivo. 12–14 Органоиды также прошли валидацию в качестве модельных систем вирусной инфекции. 15,16

Аппликации органоидов кишечника

Клеточная биология

Корни системы органоидной культуры лежат в сообществе биологов развития.В то время как эта область исследований предоставила информацию о факторах, необходимых для разработки систем моделей органоидных культур, кишечные органоидные культуры теперь возвращают ценную информацию о траектории развития ткани, для моделирования которой они были разработаны. 35 Это особенно верно для кишечных органоидов, происходящих из hPSC, которые следуют общим путям развития кишечника во время своего становления 3 и поддерживают фенотип, подобный эмбриональному, в культуре органоидов. 36 Большая полезность органоидных культур в этом контексте отчасти заключается в легкости доступа к континууму временных точек развития, что резко контрастирует с тем, что в других случаях доступно в отношении человеческих образцов.

Возможно, наиболее очевидное применение культур органоидов кишечника - это in vitro модельная система кишечного эпителия. Поскольку обе эти культуры включают все типы эпителиальных клеток, присутствующих в ткани in vivo, и воспроизводят многие, если не большую часть динамики внутри- и внутриэпителиальных клеток, которые происходят in vivo, культуры органоидов кишечника представляют собой ценный экспериментальный инструмент для исследования эпителия кишечника. клеточная биология. Таким образом, эта модельная система in vitro недавно была использована для исследования регенерации кишечника, 37,38 ниша стволовых клеток кишечника, 39–44 воспаление кишечника, 9,45–48 частота мутаций стволовых клеток кишечника 49 и функции терминально дифференцированных эпителиальных клеток кишечника (например,чувствительность к питательным веществам и секреция гормонов). 50–52

Органоиды кишечника, в частности, среди систем культивирования органоидов, также находят применение вне тканеспецифических биологических процессов и условий. Это происходит из-за активной популяции стволовых клеток и, как следствие, высокого обновления кишечного эпителия по сравнению со многими другими тканями. Активная природа ниши стволовых клеток кишечника дает ей большую полезность в качестве модельной системы для исследования более общих вопросов, касающихся биологии взрослых стволовых клеток или биологии эпителиальных клеток.Конкретные примеры применений, которые эта технология применялась недавно, включают исследование общих механизмов пролиферации взрослых стволовых клеток и рака, 53 механизмов деградации белков, 54 и поляризации эпителия. 55

Моделирование заболеваний

Культуры кишечных органоидов в настоящее время используются для моделирования кишечных заболеваний, а также заболеваний эпителия других тканей. Например, органоиды, выращенные у пациентов, несущих мутации в гене миозина 5b, могут быть использованы в качестве модели болезни включения микроворсинок (MVID), которая приводит к неправильной локализации белков на апикальной поверхности кишечного эпителия и поляризации энтероцитов. 8 Эта модель позволила получить органоиды у пациентов, проявляющих симптомы MVID, но не несущих мутаций в гене миозина 5b. При секвенировании эти образцы идентифицировали ген синтаксина 3 как способствующий потере микроворсинок.

Культуры могут быть получены из соседней здоровой и больной (канцерогенной) ткани, полученной от одного и того же пациента, 23 подход, который позволяет оценивать состояние болезни при одновременном контроле потенциально смешивающих факторов в здоровом специфическом генетическом фоне.Анализ генетического состава этих уникальных опухолей позволяет установить корреляцию между органоидным фенотипом и конкретными комбинациями мутаций. Многочисленные исследования продемонстрировали как обнаружение мутаций в комбинации APC, KRAS, SMAD4 и TP53, 21 , так и использование редактирования генов с помощью системы CRISPR / Cas9 для моделирования последовательности аденома-карцинома. 31

Ободочную кишку также можно использовать для моделирования заболеваний, не специфичных для кишечника, таких как кистозный фиброз, который обычно проявляется в легких в результате мутаций трансмембранного рецептора кистозного фиброза (CFTR).Биопсии пациентов, несущих мутации в гене CFTR, не отвечают на анализ органоидного набухания, что позволяет точно идентифицировать такие мутации. 56

Разработка и проверка лекарственных средств

Одним из наиболее многообещающих аспектов исследований с использованием органоидов в качестве модели является возможность скрининга культур, полученных из индивидуальных образцов тканей пациента, на предмет воздействия внешних воздействий. Благодаря короткому времени культивирования и возможности увеличения размеров образцов культивирование органоидов уже использовалось при скрининге конкретных пациентов.Например, ранее упомянутый анализ набухания CFTR, разработанный Бикманом и его коллегами, 56 , который обеспечивает считывание реакции на текущие лекарства или комбинации лекарств, которые улучшают транспорт хлорида через ионные каналы у пациентов с муковисцидозом. В первом испытании анализа набухания CFTR была идентифицирована комбинация лекарств, способная очистить большую часть слизи, накопившейся в легких пациента, что, таким образом, является доказательством принципиальной схемы эксперимента, которая в настоящее время движется к внедрению в правительственные платформы скрининга.

Ключевым аспектом, который все еще оптимизируется в условиях культивирования органоидов, является переход к высокопроизводительному скринингу. Шаги в этом направлении были недавно продемонстрированы разработкой автоматизированной платформы в 384-луночном формате для культур органоидов, полученных из образцов тканей пациентов с раком толстой кишки. 24 Эти органоиды были подвергнуты воздействию различных лекарственных соединений, и анализ был подтвержден на надежность и воспроизводимость, что позволило получить систему, которая обеспечивает большую физиологическую значимость, чем 2D-культуры, без ущерба для способности скрининга.

Взаимный подход направлен на более конкретные методы лечения мутационного состава библиотек образцов пациентов с использованием конкретного препарата. Группа ван Лохуйзена лечила органоидные культуры, полученные с использованием образцов тканей, взятых у 18 пациентов с диагнозом колоректальный рак, с помощью ингибитора EZh3, GSK126. 28 Хотя наблюдались различные ответы, были обнаружены ассоциации с ATRX и PAX2, а также корреляция с экспрессией BIK и Nutlin-3A.Эти результаты демонстрируют возможность апстрима фармацевтических разработок на основе скрининга библиотеки органоидов пациентов.

Перспективы органоидов кишечника

После недавнего открытия, что кишечные стволовые клетки могут создавать органоидные структуры, повторяющие кишечник млекопитающих, исследовательское сообщество быстро приняло эту органоидную модель. Такому быстрому принятию органоидов в качестве инструмента исследования способствовали два ключевых аспекта: физиологическое значение для кишечника и усовершенствования по сравнению с традиционными двумерными системами культивирования.Для трансляционных исследований органоиды обеспечивают возможность высокопроизводительного анализа образцов от отдельных пациентов, устраняя разрыв между фундаментальными исследованиями и точной медициной. Возможность создания образцов для маркерного или геномного анализа, а также для лечения лекарственными средствами или небольшими молекулами возможна в одном и том же экспериментальном дизайне.

Эти культуры также обещают расширить понимание базовой биологии стволовых клеток, что станет необходимым дополнением к трансляционным исследованиям.По самой природе системы культивирования ранние деления стволовых клеток и формирование тканей будут доступны для экспериментального анализа и манипуляции посредством редактирования гена CRISPR / Cas9.

По мере создания большего количества систем на основе органоидов становится возможным объединение нескольких конкретных типов клеток в одни и те же органоиды. Это совместное культивирование позволит идентифицировать специфические роли каждой ниши компонентных стволовых клеток, а также кооперативные и необходимые роли отдельных систем.

Области применения системы органоидных культур продолжают расширяться, и по мере их расширения наше понимание сложных взаимодействий органов, составляющих человеческое тело, механизмов, которые не работают при определенных заболеваниях, и способности быстро лечить пациентов с этими заболеваниями. ,

,

Смотрите также

MAXCACHE: 0.84MB/0.00054 sec