Блог

Эпителий кишечника развивается из


Эпителий кишечника — Студопедия

Однослойный цилиндрический каемчатый эпителий покрывает тонкий кишечник и двенадцатиперстную кишку. В этих отделах желудочно-кишечного тракта осуществляется внутриполостное и пристеночное переваривание пищи. Поверхность тонкого кишечника представлена складками, состоящими из выпячиваний – ворсинок и углублений – крипт. В слизистой тонкого кишечника наблюдается регулярное чередование ворсинок и крипт. Профиль базальной пластинки повторяет конфигурацию поверхности эпителия. Под базальной пластинкой находятся соединительная ткань, кровеносные и лимфатические капилляры, скопления лимфоидной ткани.

В однослойном эпителии тонкого кишечника различают четыре типа зрелых функционирующих клеток:

1) столбчатые (всасывающие),

2) бокаловидные (слизистые),

3) энтерохромаффинные (энтероэндокринные),

4) панетовские.

Столбчатые энтероциты составляют подавляющее большинство клеток ворсинки и крипты. С их участием осуществляется пристеночное пищеварение и всасывание питательных веществ из просвета кишечника в кровь и лимфу. Отличительными признаками столбчатых клеток являются микроворсинки, гликокаликс и межклеточные контакты.

Микроворсинки представляют собой выросты апикальной плазмолеммы энтероцита. Они имеют диаметр 100 нм и длину до 3 мкм. Внутри микроворсинки продольно располагается пучок, состоящий из актиновых нитей. У основания микроворсинки нити актина вплетены в терминальную сеть. Актино-миозиновые комплексы микроворсинок регулируют их высоту и тем самым площадь апикальной поверхности, которая при активном всасывании возрастает в несколько раз. На один зрелый энтероцит приходится до 1000 микроворсинок.


Гликокаликс располагается на поверхности микроворсинок в виде густой сети гликопротеидов. В нем фиксированы ферменты, участвующие в пристеночном пищеварении углеводов, белков и липидов, а также белки, обеспечивающие трансмембранный транспорт их мономеров. Гликокаликс совместно с микроворсинками образует на поверхности кишечного эпителия щеточную каемку, поэтому эпителий кишечника часто называют каемчатым.

Межклеточные контакты обеспечивают прочное соединение энтероцитов между собой. В кишечном эпителии встречаются следующие типы межклеточных контактов:

1. Замыкательные пластинки, расположенныев апикально-латеральных участках энтероцитов. Верхняя часть замыкательной пластинки образована плотными контактами, в районе которых электронно-плотные слои плазмолемм соседних клеток сливаются на протяжении 1-1,5 мкм. Плотные контакты энтероцитов (зоны слияния, или zona occludens) в виде ободка охватывают всю клетку. Ниже зоны слияния пространство между соседними клетками увеличено до 20-40 нм и заполнено электронно-плотным веществом, тогда как с внутренней стороны плазмолеммы находятся нити терминальной сети. Эта часть замыкательной пластинки называется зоной прилипания (zona adherens).


2. Латеральные поверхности энтероцитов ниже замыкательных пластинок соединены между собой с помощью простых контактов. Плазмолеммы соседних клеток в этом типе контакта разделены электронно-прозрачным пространством шириной 15-20 нм, содержащем компоненты гликокаликса.

3. Энтероциты могут быть связаны между собой также контактами наподобие замка, представляющими собой взаимодополняющие складки плазмолеммы.

4. Латеральные поверхности энтероцитов могут скрепляться щелевидным контактом (nexus), в которых плазмолеммы на протяжении 0,5-3 мкм разделены пространством шириной 3 нм. В образующих нексус участках плазмолеммы наблюдается гексагональная упаковка белковых глобул размером 7 нм с центральным каналом диаметром 1-2,5 нм. По этим каналам осуществляется межклеточный транспорт низкомолекулярных веществ. Щелевидные контакты распространены не только в эпителиальных, но и в других тканях.

5. В кишечном эпителии могут также встречаться десмосомы. Они представляют собой участки плазмолеммы соседних клеток, которые укреплены как снаружи, так и внутри электронно-плотным веществом, формирующим диск или поясок вокруг клетки. Со стороны цитоплазмы к диску подходят пучки тонофиламентов.

6. К подлежащей базальной пластинке эпителиальные клетки прикреплены с помощью гемидесмосом (полудесмосом), которые имеют структуру половины десмосомы с дополнительным, богатым липидами слоем между диском и базальной пластинкой.

Клетки однослойного эпителия прочно связаны с базальной пластинкой. В световом микроскопе базальная пластинка выявляется как граница между эпителием и подлежащей соединительной тканью, но сама непосредственно не видна. В электронном микроскопе видно, что она имеет толщину около 100 нм и состоит из двух слоев: светлого подъэпителиального толщиной 40 нм и сетчатого толщиной 60 нм. Светлый слой содержит углеводы, белки, большое количество ионов кальция. Сетчатый слой состоит из коллагена и гликозаминогликанов. Базальная пластинка является продуктом взаимодействия эпителия с соединительной тканью.

Столбчатые клетки составляют более 90 % всех клеток кишечного эпителия, выстилая поверхность ворсинки. На втором месте по численности в тонком кишечнике стоят бокаловидные клетки, которые выполняют секреторные функции. Выделяемая ими в просвет кишечника слизь содержит белки и углеводы, обеспечивающие механическую защиту энтероцитов, а также создающие оптимальные условия для работы пищеварительных ферментов.

Эти клетки отличаются более тонкой базальной частью, в которой располагаются клеточное ядро, плазматическая сеть, митохондрии, пластинчатый комплекс и другие органоиды, и расширенной апикальной частью, содержащей различного размера пузырьки со слизью. Как свидетельствуют результаты авторадиографического исследования, белковый компонент слизи синтезируется на мембранах плазматической сети, тогда как углеводный компонент образуется в пластинчатом комплексе. Сформировавшиеся в пластинчатом комплексе пузырьки со слизью отделяются от этого органоида и перемещаются к апикальной поверхности клетки, где сливаются с плазмолеммой и выводят слизь наружу.

В эпителии тонкого кишечника обнаруживаются также энтерохромаффинные (энтероэндокринные) клетки. От других энтероцитов они отличаются аргирофильными секреторными гранулами, локализованными в базальной части клетки. Энтерохромаффинные клетки синтезируют и выделяют ряд гормонов и других биологически активных веществ - энтеринов, которые регулируют функции пищеварительной системы, а также оказывают влияние на трофику других физиологических систем организма.

Самые малочисленные из всех энтероцитов клетки Панета никогда не покидают дна крипты. Они содержат крупные гранулы в апикальной части клетки, которые содержат интерфероны и другие белки, обеспечивающие функции местного иммунитета.

Клетки эпителия кишечника постоянно обновляются. Время жизни большинства энтероцитов не превышает 3-4 суток. Столь высокие темпы физиологической регенерации обеспечиваются постоянной пролиферацией стволовых клеток, которые локализованы в стенке крипты. Клетки Панета дифференцируются сразу же после деления стволовых клеток и смещаются ко дну крипты. Эти клетки делятся очень редко. Предшественники энтерохромаффинных клеток делятся два раза, смещаясь в сторону ворсинки. Бокаловидные клетки образуются после трех делений, а столбчатые клетки – после четырех делений, также смещаясь к вершине ворсинки. На вершине ворсинки все три типа клеток погибают путем апоптоза и слущиваются в просвет кишечника.

Гистофизиологию эпителия тонкого кишечника можно рассмотреть также с позиций теории дифферона. Дифферон – это клеточный клон, образованный стволовой клеткой. В эпителии тонкого кишечника одна его граница совпадает с дном крипты, где расположены клетки Панета, а другая – с вершиной ворсинки, где погибают энтероциты. Началом дифферона будет стенка крипты, где локализованы стволовые клетки. Дифферон тонкого кишечника стабилен, он постоянно воспроизводится за счет деления недифференцированных клеток.

Этот же тип дифферона характерен и для других отделов желудочно-кишечного тракта. Если сравнить, например, тонкий и толстый кишечник, то, несмотря на определенные различия, вполне просматривается общность структурно-функциональной организации этих тканей. Поверхность толстого кишечника гладкая, без ворсинок, внешне не похожая на тонкий кишечник. Она покрыта столбчатыми клетками, которые хотя и обладают сходством с аналогичными клетками тонкого кишечника, отличаются меньшим количеством микроворсинок.

Функция этих клеток состоит во всасывании воды. Количество бокаловидных клеток в толстом кишечнике увеличено. Они сконцентрированы в глубоких складках, образуя выделяющие слизь либеркюновы железы. Усиленная продукция слизи толстым кишечником необходима для формирования каловых масс. Таким образом, эпителий толстого кишечника также состоит из дифферонов кишечного эпителия, но по сравнению с тонким кишечником они несколько видоизменены в связи с их иной функциональной специализацией.

Эпидермис

Кожа образована эпителием и подлежащей соединительной тканью. Эпителиальная часть кожи – эпидермис  - представляет собой плоский многослойный ороговевающий эпителий.

В эпидермисе выделяют пять слоев клеток в направлении от базальной пластинки к поверхности:

1.  Базальный слой, состоящий из одного ряда делящихся клеток цилиндрической формы.

2. Шиповатый слой, образованный 4-8 рядами делящихся клеток крыловидной формы.

3. Зернистый слойиз 3-4 рядов уплощенных неделящихся клеток с гранулами.

4. Блестящий слой из 1-2 ряда сильно уплощенных погибающих клеток.

5. Роговой слой, состоящий из многих рядов плоских мертвых клеток.

Базальный слой располагается непосредственно на базальной пластинке. В цитоплазме клеток базального слоя обнаруживаются тонофиламенты, митохондрии, пластинчатый комплекс, ядра с крупными ядрышками и мелкодисперсным хроматином. Пальцевидные выросты базальной поверхности клеток вдаются в базальную пластинку, заканчиваясь гемидесмосомами. Клетки этого слоя интенсивно пролиферируют, причем их потомство смещается в вертикальном направлении. В базальном слое находятся стволовые клетки эпидермиса, обладающие способностью к самоподдержанию.

Шиповатый (крылатый, остистый) слой образован клетками неправильной формы, имеющими крыловидные отростки. Отростки заканчиваются десмосомами, которые прочно скрепляют клетки между собой. Цитоплазма клеток богата органоидами, многочисленные тонофиламенты собраны в пучки – тонофибриллы. Клетки этого слоя еще способны делиться, поэтому его вместе с базальным слоем объединяют в единый ростковый слой.

Зернистый слой состоит из клеток уплощенной формы, также соединенных между собой десмосомами. В цитоплазме хорошо видны базофильные гранулы кератогиалина величиной до 1 мкм, которые содержат профиллагрин, необходимый для последующей агрегации кератиновых тонофибрилл. Клеточные ядра клеток зернистого слоя отличаются пикнотичностью и уже не способны делиться.

Блестящий слой обнаруживается только в коже ладоней и подошв. Он образован сильно уплощенными клетками, которые заполнены предшественником кератина – элеидином. Органоиды в цитоплазме этих клеток деградируют, а ядра подвергаются кариорексису, что свидетельствует о развитии процессов клеточной гибели.

Роговой слой эпидермиса представлен многочисленными роговыми чешуями, которые обеспечивают физическую и химическую защиту организма. Роговые чешуи – это не что иное, как плоские мертвые, лишенные ядра эпителиальные клетки, около 80 % массы которых составляют промежуточные филаменты из белка кератина. Клетки в толще рогового слоя еще прочно скреплены между собой десмосомами, однако по мере приближения к поверхности клеточный пласт разрыхляется под воздействием выделяющихся в межклеточное пространство лизосомальных ферментов. Одновременно клетки теряют до 70 % собственной массы из-за высыхания. Десквамация (слущивание) роговых чешуй обеспечивает защитные функции эпидермиса.

Эпидермис отличается интенсивной физиологической регенерацией, полностью обновляясь через неделю. Этот процесс обеспечивается постоянным делением стволовых клеток и коммитированного потомства в ростковом слое, дальнейшей дифференцировкой неделящихся клеток зернистого слоя и их гибелью при переходе к роговому слою. Ообенностью эпидермиса как ткани является то, что основную нагрузку принимают на себя мертвые клетки, которые, однако, находятся под контролем живых клеток нижележащих слоев.

Очевидно, что дифферон многослойного эпителия является более сложным по сравнению с диффероном кишечного эпителия. Недаром многослойный эпителий имеется только у позвоночных животных. Мягкий гидролиз белков десмосом эпидермиса позволяет выделить его диффероны, которые напоминают перевернутые пирамиды. В отличие от однослойного эпителия лишь незначительная часть клеток дифферона этого типа непосредственно связана с базальной пластинкой. Остальные клетки формируют клеточный пласт с помощью десмосом и других межклеточных контактов, что требует высокой координации их пролиферации и дифференцировки.

Другой формой многослойного эпителия является многослойный неороговевающий эпителий роговицы глаза.

В отличие от эпидермиса этот эпителий имеет три слоя:

1.  Базальный слой, сходныйсбазальнымслоем эпидермиса.

2. Шиповатый слой, которыйотличается полигональной формой клеток и диффузным расположением кератиновых тонофиламентов, не образующих пучки.

3. Поверхностный слой, состоящий из уплощенных гибнущих клеток, которые постоянно удаляются путем десквамации.

Сходную структуру имеют многослойный неороговевающий эпителий полости рта, глотки, пищевода, влагалища и других органов эктодермального происхождения.

Связь с болезнями и регуляция фитохимическими веществами

Кишечник играет важную роль в интеграции иммунитета, переваривания и усвоения питательных веществ. Соседний кишечный эпителий образует плотные соединения (TJ), которые необходимы для функционирования физического кишечного барьера, регулируя параклеточное движение различных веществ, включая ионы, растворенные вещества и воду, через эпителий кишечника. Исследования показали, что дисфункция TJ тесно связана с метаболическими и воспалительными заболеваниями.Таким образом, молекулярные факторы и факторы питания, которые улучшают активность TJ, привлекли внимание в фармацевтической и медицинской областях. В этом обзоре основное внимание уделяется связи между TJ и различными патологическими состояниями, а также различным молекулярным и нутритивным вмешательствам, направленным на повышение целостности TJ.

1. Введение

Кишечный эпителий образует слизистую оболочку тонкой кишки. Каждый эпителий имеет щеточную кайму, ворсинки, крипту и структуру базолатеральной плазматической мембраны.Тонкий кишечник не только поглощает питательные вещества из пищи, но и создает физический барьер, которому помогают плотные соединения (TJ), образованные соседними эпителиальными клетками, и биологический барьер, которые действуют против внеклеточных веществ, таких как микроорганизмы, антигены и т. Д. ксенобиотики (рисунок 1). Более того, тонкий кишечник выделяет широкий спектр гормонов, которые регулируют его внутренние функции, а также энергетический обмен во всем организме.


Основная функция тонкого кишечника - усвоение питательных веществ.Кишечный эпителий экспрессирует пищеварительные ферменты, переносчики определенных питательных веществ и метаболические ферменты. Тонкий кишечник также опосредует передачу сигналов и производит биологически активные соединения. Эпителий кишечника реагирует на различные воспалительные и окислительные стрессы, вызванные бактериальными токсинами, провоспалительными цитокинами (TNF- α и IL-1 β ) и другими компонентами через различные рецепторы, включая толл-подобные рецепторы (TLR) в плазме. мембрана эпителия.

TJ вносят вклад в функцию физического кишечного барьера, регулируя параклеточное движение ионов, растворенных веществ и воды через эпителий кишечника, в то время как система детоксикации создает биологический барьер против ксенобиотиков. Кроме того, целостность TJ связана с функциями кишечного эпителия. Данные клинических испытаний и фундаментальных научных исследований показывают, что барьер TJ играет важную роль в патогенезе системных и кишечных расстройств.Таким образом, в этом обзоре будет обсуждаться связь между TJ и различными метаболическими и воспалительными заболеваниями, а также молекулярный контроль и контроль питания TJ кишечника.

2. Белки, связанные с плотными и плотными соединениями

TJ генерируется сборкой множества белков, расположенных рядом с апикальной частью эпителия между соседними клетками (рис. 2), и контролирует проницаемость параклеточного транспортного пути. TJ играет ключевую роль в поддержании барьерной функции кишечника и состоит из двух функциональных категорий белков, интегральных трансмембранных белков, которые образуют сеть между соседними клеточными мембранами и белками периферической мембраны или бляшек.Целостность TJ динамически регулируется расположением актина и взаимодействием между интегральными трансмембранными и периферическими мембранными белками. Четыре интегральных трансмембранных белка - это окклюдин, клаудин, соединительная молекула адгезии (JAM) и трицеллюлин. Адаптерные белки периферической мембраны zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2 и ZO-3 действуют как мосты для соединения интегральных мембранных белков с актиновым цитоскелетом и с другими сигнальными белками. Уровни фосфорилирования, распределения и экспрессии белков TJ играют решающую роль в регуляции барьерной функции TJ.Они жестко регулируются следующими путями внутриклеточной передачи сигналов: передача сигналов протеинкиназы C (PKC), A (PKA) и G (PKG); фосфатаза, Rho, киназа легкой цепи миозина (MLC) (MLCK) и передача сигналов MAPK; и путь PI3K / Akt [1, 2].


2.1. Окклюдин

Окклюдин высоко экспрессируется в сайтах межклеточного контакта и считается важным для сборки и поддержания TJ. Он состоит из четырех трансмембранных доменов и двух внеклеточных петель.Фосфорилирование окклюдина коррелирует с регуляцией его локализации и функции. Окклюдин, который фосфорилируется по остаткам серина / треонина, локализуется в основном в мембране, тогда как менее фосфорилированный окклюдин обнаруживается в цитоплазме. Кроме того, фосфорилирование окклюдина, по-видимому, контролирует его взаимодействие с другими белками TJ, такими как ZO-1 [3]. Взаимодействие между окклюдином и ZO-1 важно для целостности TJ [4]. Таким образом, фосфорилированный окклюдин регулирует стабильность и проницаемость TJ [5].В соответствии с этими наблюдениями, мыши с нокаутом окклюдина имели нормальную структуру TJ, но демонстрировали повышенное воспаление, гиперплазию и задержку роста [6]. С другой стороны, повышенный уровень окклюдина играет роль в дальнейшем улучшении барьерной функции TJ и предотвращении повреждения TJ [7].

2.2. Claudin

Хотя нет гомологии последовательностей между окклюдином и клаудином, семейство клаудина также состоит из четырех трансмембранных доменов и двух внеклеточных петель, которые конструируют нити TJ (Figure 1).Семейство клаудинов состоит из 23 интегральных мембранных белков. Внеклеточные петли клаудина принимают участие в гетерофильных и гемофильных взаимодействиях с соседними клетками, которые создают барьеры или поры для прохождения селективных молекул в параклеточных путях [8, 9]. Считается, что могут существовать 27 генов клаудина у млекопитающих, хотя их классификация как клаудинов оспаривается [10]. При тестировании экспрессии клаудинов-1-24 в кишечнике крыс и мышей все клаудины, кроме 6, 16, 19, 22 и 24, были обнаружены с помощью ПЦР-анализа [11].Хотя необходимы дополнительные исследования для определения точных функций клаудинов в TJs, исследования на животных показали важность клаудинов в целостности TJs. Мыши с дефицитом клаудина-1 демонстрировали аномальное формирование барьера TJ, что индуцировало развитие рака и метастазирование [12]. Мыши с дефицитом клаудина-2 или клаудина-15 в тонком кишечнике показывают, что эти трансмембранные белки играют важную роль в трансэпителиальной парацеллюлярной проницаемости, подобной проницаемости внеклеточных моновалентных катионов, особенно Na (+), как у младенцев, так и у взрослых [13].

2.3. Zonula Occludens

Белки ZO, которые включают ZO-1, ZO-2 и ZO-3, были первыми обнаруженными TJ-специфическими белками [14]. ZO соединяет соединительные белки, такие как окклюдин и клаудин, с актиновым цитоскелетом, и эти взаимодействия белков поддерживают образование и функцию TJ. На сегодняшний день роль белков ZO в TJs полностью не изучена. Исследования показывают, что хотя ZO-1-дефицитные клетки могут поддерживать структуру TJs и проявлять нормальную проницаемость, активность др. Белков TJ, таких как occludin и claudins, в сборке TJs задерживается в этих клетках [8, 15, 16].С другой стороны, дефицит ZO-2 или ZO-3 не влиял на образование TJ в типах эпителиальных клеток [15], предполагая, что белки ZO-1 играют более важную роль в контроле сборки TJ по сравнению с ZO -2 или ЗО-3.

3. Нарушение плотного соединения

Целостность кишечного эпителиального барьера, поддерживаемого TJ, имеет решающее значение для защиты организма от стрессовых стимулов, связанных с воспалением и инфекцией. Считается, что изменение гомеостаза TJ вызывает патогенез нескольких заболеваний, а - наоборот .Факторы, связанные с изменением гомеостаза TJ, включают провоспалительные цитокины, патогенные бактерии, липополисахариды (LPS) и патологические состояния.

3.1. Провоспалительные цитокины

Провоспалительные цитокины, такие как TNF- α , IL-1 β и IFN γ , способствуют проницаемости TJ. TNF- α подавляет барьерную функцию TJ из-за активации пути NF- κ B и снижения уровня белка ZO-1 [17]. Напротив, блокирование пути NF- κ B устраняет опосредованное TNF- α открытие барьера TJ и подавление ZO-1.Интересно, что сайт обработки TNF- α в монослоях клеток Caco-2, выращенных на фильтре, был важен. Обработка TNF- α в базолатеральном компартменте, но не в апикальном компартменте, значительно повлияла на целостность TJ. Подробный молекулярный механизм действия TNF- α был дополнительно изучен in vitro. Было высказано предположение, что увеличение экспрессии и активности MLCK связано с NF- κ B-опосредованным нарушением TJ [18].Поскольку промоторная область КЛЦМ содержит сайт связывания NF- κ B, обработка TNF- α увеличивала активность промотора КЛЦМ и транскрипцию за счет активации NF- κ B [19]. Впоследствии повышенные уровни белка MLCK и его активности способствовали проницаемости TJ в клетках Caco-2. Сходным образом IL-1 β увеличивал проницаемость TJ посредством активации пути NF- κ B [20]. Активация КЛЦМ с помощью внеклеточных сигнальных путей киназ 1/2 (ERK1 / 2) также связана с изменениями в TJ, опосредованными IL-1 β [21, 22].В отличие от TNF- α , обработка IL-1 β не влияла на уровень белка ZO-1, но подавляла уровень белка окклюдина [

.Мини-обзор

: Культура органоидов кишечника

Эпителий кишечника

Просветная поверхность кишечного тракта млекопитающих состоит из одного слоя быстро самообновляющихся эпителиальных клеток, которые могут быть полностью восполнены в течение пяти дней. 1 Эпителий делится на две отдельные области, которые обозначаются доменами крипты и ворсинки. Домен крипт расположен в самой базальной части кишечного эпителия и находится в прямом контакте с базальной мембраной.Крипты содержат стволовые клетки кишечника (ISC). Напротив, домен ворсинок расположен на апикальной поверхности кишечного эпителия и состоит из нескольких типов дифференцированных клеток. 1

Существует пять преобладающих типов клеток, которые составляют эпителий кишечника. 1 Пролиферативные стволовые клетки расположены в терминальной области крипты и фланкированы клетками Панета, которые секретируют цитокины, которые помогают поддерживать нишу стволовых клеток.Клетки Панета также ответственны за секрецию антимикробных пептидов. 1 Стволовые клетки делятся симметрично и либо обновляют популяцию стволовых клеток в основании крипты, либо начинают дифференцироваться, становясь частью быстро делящейся транзитной усиливающейся популяции крипты, в зависимости от конкретного местоположения делящейся стволовой клетки в крипте. Транзитные амплифицирующие клетки движутся апикально к ворсинкам, где они окончательно дифференцируются в абсорбирующие энтероциты, энтероэндокринные клетки, секретирующие гормоны, или бокаловидные клетки, секретирующие слизь.Зрелые эпителиальные клетки продвигаются вверх по ворсинкам, где они в конечном итоге отслаиваются от кончика ворсинок в просвет. 1

Лишь недавно популяция пролиферативных стволовых клеток кишечника взрослого человека была окончательно идентифицирована в экспериментах по отслеживанию клонов как состоящая из столбчатых клеток, которые интеркалированы с клетками Панета в основании крипт. 2 Эти клетки экспрессируют LGR5, белок в сигнальном пути WNT, и могут давать начало всем типам клеток кишечника взрослого человека.Дальнейшие исследования показали, что популяции стволовых клеток, расположенных за пределами основания крипты, особенно клетки в положении +4 крипты, могут превращаться в мультипотентные стволовые клетки при повреждении кишечника. 3 Эти данные демонстрируют пластичность стволовых клеток и клеток-предшественников в ткани кишечника, которая необходима для поддержания гомеостаза в суровых условиях просвета кишечника.

Стволовые клетки LGR5 + сохраняют свою способность к самообновлению и регенерации кишечного эпителия в первую очередь благодаря своему положению в нише стволовых клеток. 4 Кишечная ниша хорошо охарактеризована и, как было показано, состоит из пространственных градиентов высокого WNT и фактора роста эпителия (EGF), в то время как сигналы костного морфогенетического белка (BMP) подавлены. 5 Изучение этой определенной ниши привело к модели нейтрального дрейфа. В рамках этой модели стволовые клетки делятся симметрично в пространственно ограниченной нише. Эта пролиферация обязательно приводит к удалению некоторых стволовых клеток из ниши, в то время как оставшиеся стволовые клетки сохраняют свое положение в основании крипт и, следовательно, сохраняют свою «стволовость». 6 Со временем стволовые клетки в данной крипте дрейфуют в сторону клональности, поскольку потомство соседних стволовых клеток исключается из ниши.

Детальные знания, которые были собраны ранее относительно клеточных линий и функций кишечного эпителия в сочетании с постоянно обновляющейся природой этой ткани, делают эту систему привлекательной модельной системой для изучения общих характеристик эпителиальных тканей и взрослых стволовых клеток, а также специфические характеристики слизистой оболочки кишечника, связанные с заболеванием и дизайном лекарств.

История органоидов кишечника

Исследования с использованием генетических манипуляций с моделями мышей и иммортализованными клеточными линиями, такими как линия аденокарциномы CACO-2, привели к значительному пониманию функции кишечника, включая роль отдельных типов клеток, составляющих эту эпителиальную ткань. 7 Частично благодаря этим знаниям может быть разработана ex vivo долгосрочная модель кишечного эпителия, начатая с нативных, нетрансформированных первичных клеток.Ранние попытки создать такую ​​культуральную систему привели к моделям, в которых кишечные стволовые клетки могли временно делиться, но теряли способность к пролиферации в течение нескольких недель. 8,9

Первый опубликованный отчет о культуральной системе, которая может способствовать долгосрочному выживанию кишечных стволовых клеток, был сделан группой доктора Кальвина Куо. 10 Посредством культивирования фрагментов кишечника, содержащих эпителиальные и мезенхимальные клетки, от новорожденных мышей Ootani et al.разработал модель интерфейса воздух-жидкость, которая при добавлении фетальной бычьей сыворотки образовывала кистообразные структуры, содержащие все основные типы клеток кишечника взрослой мыши. При правильном кормлении эти культуры могут сохраняться более одного года. 10

В том же году группа доктора Ханса Клеверса опубликовала альтернативный метод культивирования кишечных крипт, в котором отсортированные одиночные клетки LGR5 + из кишечника взрослой мыши использовали в качестве исходного материала для модели культуры ткани ex vivo.Вместо границы раздела воздух-жидкость, эта система имитировала внеклеточный матрикс путем культивирования крипт в полутвердом, богатом ламинином / коллагеном полушарии Matrigel®. Использовали среду для культивирования клеток, имитирующую нишу стволовых клеток в крипте, которая в сочетании с полутвердым матриксом обеспечивала возможность длительного культивирования этих клеток. По сравнению с кистозными структурами, описанными Ootani et al., 10 , эти «органоиды» содержали центральный просвет, окруженный «зачатками», которые представляют собой кишечные крипты (Рисунок 1).Эти криптоподобные домены функционально аналогичны доменам кишечника взрослого человека, поскольку делящиеся стволовые клетки LGR5 + интеркалируются клетками Панета и располагаются в основании крипт. Следовательно, эти органоиды представляют собой физиологически значимый фенотип. В системе, разработанной группой Клеверса, стволовые клетки LGR5 + делятся с образованием популяции самообновляющихся стволовых клеток, а также клеток, которые окончательно дифференцируются в энтероциты, энтероэндокринные клетки или бокаловидные клетки.Окончательно дифференцированные клетки в конечном итоге вытесняются в просвет из ворсиноподобного домена, имитируя физиологическое обновление эпителия кишечника взрослых. Органоиды, культивируемые таким образом, также могут сохраняться неограниченное время с периодической диссоциацией и пассированием клеток (рис. 2). 5 Таким образом, это достижение представляло собой создание новой модельной системы, которая объединяет многие физиологические свойства моделей in vivo мышей с простотой культивирования и возможностью манипулировать конкретными переменными в клеточной среде, которые типичны для моделей культур клеток in vitro. .

Рисунок 1. Морфология органоидов кишечника.

Схема зрелого кишечного органоида (слева) и изображение в светлом поле зрелого кишечного органоида (день 5) мыши (справа). Центральный просвет окружен эпителиальным монослоем с почкующимися криптоподобными доменами.

Рисунок 2. Прохождение органоидов кишечника.

Репрезентативные изображения органоидов кишечника мышей из исходных крипт: пассаж 0 - день 3, пассаж 1 - день 3, пассаж 2 - день 3, пассаж 5 - день 3, демонстрирующие сохранение фенотипа почкования (масштабная полоса = 200 мкм).

Культивирование органоидов кишечника

Разработка более последовательной и стабильной среды для культивирования клеток, которая позволяет криптоподобным структурам органоидов кишечника сохранять свою стволовость, была ключевым фактором в обеспечении успешного культивирования органоидов.Ниша кишечных стволовых клеток требует точного градиента активности множества сигнальных путей для поддержания надлежащего гомеостаза кишечника. Среда для культивирования клеток, опубликованная доктором Тоширо Сато из группы Клеверса, имитирует эту среду, включая цитокины EGF и R-Spondin1 для активации путей EGF и WNT, соответственно, а также Noggin для ингибирования передачи сигналов BMP. 5

Использование кишечных органоидов в качестве модельной системы культуры

Органоиды - ценная модель для изучения биологии эпителиальных стволовых клеток, а также структурных и функциональных механизмов кишечника.Хотя эта технология все еще находится в зачаточном состоянии, уже были предприняты различные исследования, подтверждающие правильность концепции, которые подтверждают широкий спектр приложений. Органоиды, выращенные из кишечных крипт мышей, могут подвергаться изменениям в экспрессии генов посредством трансфекции ДНК или малой интерферирующей РНК, а также вирусной инфекции адено- или лентивирусом. 11 Быстрое распространение органоидов в культуре позволяет использовать их в различных аналитических процедурах, включая микроматрицы, секвенирование, иммуногистохимию и масс-спектрометрию. 12,13 Органоиды также можно замораживать для длительного хранения. Некоторые недавние исследования с использованием органоидных культур можно сгруппировать в следующие категории исследований:

Биология стволовых клеток

Незадолго до развития органоидных культур мечение клеток и анализ клональных клеток привели к более окончательному пониманию динамики стволовых клеток в кишечном крипте. Было известно, что популяция LGR5 + в основании крипт подвергается стохастическим симметричным делениям, которые поддерживают пул стволовых клеток и популяцию, усиливающую транзит. 6,14 Последующие исследования с использованием органоидов выявили сложную роль интеркалирующих клеток Панета в поддержании стволовых клеток. Истощение клеток Панета соответствует потере + клеток LGR5 из основания крипты. 15 Было показано, что клетки Панета секретируют цитокины, такие как WNT, которые необходимы для поддержания ниши стволовых клеток. Было также продемонстрировано, что эти клетки проявляют дифференциальную чувствительность к бактериальным лигандам, цитокинам и мускаринергической стимуляции. 15,16 По мере того, как становится яснее понимание специфических ролей отдельных типов клеток, становится возможным нацелить эти клетки на лечение заболеваний, возникающих из-за их аномалий. Примером такого нацеливания может быть терапия, направленная на мутации клеток Панета при воспалительном заболевании кишечника.

Болезни человека

Система культивирования органоидов включает в себя ключевые атрибуты, которые делают ее ценным инструментом для изучения болезней человека: во-первых, органоиды были получены из стволовых клеток кишечника, выделенных из биоптатов человека; 17,18 и вторые, отдельные отсортированные клетки EPHB2 + , которые располагаются в основании крипт, могут расти в органоидные культуры. 18 Такие органоиды можно использовать для изучения клеточных механизмов, лежащих в основе кишечных заболеваний, путем изучения экспрессии генов или манипуляций с ними.

Подавление механизмов, контролирующих пролиферацию и гибель клеток, играет роль во многих кишечных заболеваниях. Такие заболевания, как болезнь Крона, язвенный колит, целиакия и сепсис, приводят к неконтролируемой активации иммунной системы, что в конечном итоге приводит к повреждению кишечника. Микроскопия и колориметрические анализы с использованием кишечных органоидов были разработаны для изучения функции генов в выживании и гибели эпителиальных клеток. 19

Органоиды также являются ценным инструментом для изучения механизмов рака кишечника ex vivo. Органоиды кишечника мышей, дефицитные по гену аденоматозного полипоза coli (Apc), демонстрируют конститутивно активную передачу сигналов WNT и являются канцерогенными при введении голым мышам, давая высокопролиферативные канальцевые эпителиальные железы, сопровождаемые выступающей стромальной тканью. 15 Дальнейшие исследования позволили проанализировать взаимодействия между сигнальными путями MAPK и WNT при прогрессировании опухоли.Онкоген BRAF является наиболее распространенной мутацией в зубчатых аденомах на сидячей мышце, и его избыточная экспрессия у трансгенных мышей приводит к усилению активности MAPK. Органоиды, полученные от мышей, несущих мутацию BRAFV600K, демонстрируют быстрое развитие генерализованной зубчатой ​​дисплазии, а также демонстрируют истощение пула стволовых клеток в основаниях доменов крипт. Было обнаружено, что этой потере стволовых клеток противодействует активность WNT / бета-катенина, демонстрируя возможный отказоустойчивый механизм, в котором передача сигналов MAPK / BRAF защищает ткань кишечника от онкогенной активации. 20

Архитектура модели органоидов также подходит для исследований, специфичных для иммунной системы. Wilson et al. обратились к антимикробному ответу клеток Панета путем создания модели кишечной инфекции, включающей инъекцию бактериального патогена непосредственно в просвет органоидов. 21 Эта техническая разработка предлагает новую модель для исследования взаимодействий хозяин-микроб.

Генная терапия

Органоиды могут быть подвергнуты вирусному заражению определенными векторами.Органоиды также могут быть трансплантированы мышам-реципиентам после того, как было вызвано повреждение кишечника. 22 Эти два атрибута позволяют решать вопросы, связанные с исправлением конкретных болезнетворных мутаций. Поскольку органоиды могут быть выращены из отдельных стволовых клеток, клональные органоиды могут быть созданы и проанализированы после трансфекции. Это позволяет осуществлять точную трансплантацию органоидов с надлежащей интеграцией введенного генетического материала и является убедительным аргументом в пользу органоидов как терапевтического инструмента на основе клеток.Два недавних исследования были сосредоточены на разработке анализа и последующей генной заместительной терапии рецептора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) с использованием органоидных культур в качестве неотъемлемых компонентов. Dekkers et al. разработали анализ на основе органоидов, в котором добавление лекарственного средства форсколина вызывало цАМФ-индуцированное быстрое набухание органоидов дикого типа в образцах кишечника мыши и человека. Они продемонстрировали, что вызванное лекарством набухание было значительно уменьшено у мышей, несущих мутацию F508del в CFTR, тем самым установив методологию оценки генной терапии, направленной на мутацию CFTR. 23 Schwank et al. использовали этот анализ и использовали систему CRISPR / CAS9, в которой посредством индуцированной гомологичной рекомбинации они могли специфически корректировать аллель CFTR F508del. Органоиды, несущие спасенный аллель, восстановили способность набухать под действием форсколина, демонстрируя доказательство принципа генной заместительной терапии. 24

Другие приложения

Помимо исследований конкретных сигнальных путей, органоиды также предоставляют возможность для широкомасштабного скрининга лекарств.Скрининг на основе органоидов может быть либо дополнением к двумерному скринингу, выполняемому с использованием клеток CACO-2, либо служить для замены этих анализов на основе клеточных линий более физиологически релевантной модельной системой. 25 Были проведены экспериментальные эксперименты с использованием органоидов для исследования влияния малых молекул на физиологию стволовых клеток. Например, обработка органоидов комбинацией вальпроевой кислоты и небольших молекул, ингибирующих GSK3Beta и гистондеацетилазу, привела к значительному увеличению количества стволовых клеток LGR5 + и 100-кратному увеличению эффективности образования колоний, что предполагает роль этих молекул в стволовых клетках. поддержание. 26 Дальнейший первичный скрининг воздействия малых молекул на органоиды дикого типа и больные органоиды может оказаться инструментом прогнозирования для расширения существующих методик ADMET (адсорбция, распределение, метаболизм, экскреция, токсикология). Spence et al. продемонстрировали, что образование органоидов не ограничивается выделением стволовых клеток из первичных тканевых источников. Эта группа продемонстрировала способность направлять дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды кишечника in vitro, используя временную серию манипуляций с факторами роста, которые имитируют сигналы, присутствующие в течение

.

Эпителиум кишечник - Википедия

Статья в Википедии, свободная энциклопедия.

L ' épithélium Кишечный est la couche de cellules qui recouvre les villosités de l'intérieur de l'intestin et qui fait la liaison entre l'intérieur de l'intestin et l'intérieur de l'organisme.

Cet épithélium est de type prismatique unistratifié (ou simple) à plateau strié.

Лесные биологи наблюдают за типами эпителиевых клеток:

Les entérocytes [1] , des cellules haute et étroites, aux noyaux allongés в хроматиновой дисперсии.Leur pôle apical est pourvu de microvillosités afin d'augmenter la surface de contact extérieure. Leur rôle est un rôle d'échange (поглощение мелких молекул, d'ions et d'eau).

Les cellules caliciformes [2] : это клетки железистых желез с слизью, очищенной от слизи на основе. La partie supérieure contient le cytoplasme chargé de слизи. Celui-ci apparait blanc au microscope s'il n'est pas mis en évidence, Rouge via mucicarmin or a la colour PAS et bleu via le bleu alcian.Leur rôle est de lubrifier et protéger l'épithélium avec son слизь.

Les lymphocytes intraépithéliaux.

Les cellules souches qui forment deux populations: ячейки, расположенные на основе криптовалюты, разделенной на постоянный ритм для обновления эпителия. Les cellules souches situées à la quatrième position en partant du bas des cryptes, ont une Division activée по причине агрессии или инфекции кишечного эпителия [3] .

Les cellules de Paneth au fond des villosités Кишечник.

Les cellules entéroendocrines qui produisent des гормонов и др. нейропептиды, такие как соматостатин, серотонин и глюкагон, перметант регулятора метаболизма кишечных клеток.

Pendant de nombreuses années, les cellules épithéliales coetaient considérées, напоминающие структуру участника пищеварения, реального соединения с кишечными микробами. Leur seul rôle actif reconnu était d'assurer l'absorption sélective des aliments.Par contre, les biologistes considéraient qu'elles faisaient partie d’une barrière Totalement, пассивный по отношению к nombreux antigènes, présent dans la lumière кишечника. Depuis les années 1990, plusieurs études traduisent un véritable change de paradigme en démontrant la Participation active de la cellule épithéliale à l’homéostasie интестиналь. L’épithélium gastinal est désormais considéré комментирует динамику интерфейса, формирует безупречный физический облик, химический барьер и иммунитет, играет на бис с мажорным участием микробиоты [4] .

  1. ↑ http://bio.m2osw.com/gcartable/enterocyte.htm
  2. ↑ « Cellule caliciforme - Определение », sur Journal des Femmes Santé (см. Le 12 août 2020) .
  3. (ru) Potten CS (1998) Стволовые клетки желудочно-кишечного эпителия: количество, характеристики и смерть. Философские труды Лондонского королевского общества 353: 821-830
  4. ↑ Лилия Зуитен-Мекки, Мерием Сергини, Мония Феких, Ламия Каллель, Самира Матри, Надя Бен Мустафа, Джалель Бубакер и Азза Филали, « Rôle de la cellule épithéliale dans l'homéostasires chinstasiés chinstasiés chinstinale et al. », Med Sci (Париж) , т. 29, n o 12, , p. 1145-1550 (DOI 10.1051 / medsci / 20132912019) .
.

Обзор - Органоиды кишечника - Органоиды - Области интересов

Органоиды кишечника

Культуры органоидов кишечника - это трехмерные (3D) модели ткани in vitro, которые включают многие физиологически важные особенности ткани кишечника in vivo. Эти особенности включают поляризованный эпителиальный слой, окружающий функциональный просвет, и все типы клеток кишечного эпителия, присутствующие в пропорциях и относительном пространственном расположении, которые повторяют то, что наблюдается in vivo.

В течение последнего десятилетия произошел резкий сдвиг в доступности инструментов и модельных систем, используемых для изучения кишечного эпителия, с развитием и внедрением кишечных органоидных культур, занимающих центральное место в этом движении. С момента появления модели органоидов тонкого кишечника мышей в 2009 г., –1, в этой области произошел лавинообразный рост, в том числе создание условий культивирования органоидов человека, полученных из первичной ткани толстой кишки, 2 , а также плюрипотентной ткани человека. стволовые клетки (чПСК). 3 Различные экспериментальные методики также были разработаны параллельно и применены к культурам кишечных органоидов с синергетическим с научной точки зрения эффектом. Некоторые из этих методов включают новые инструменты для генетической манипуляции, 4,5 подходы к моделированию заболеваний in vitro 6–9 и инновационную систему совместного культивирования с аутологичными типами клеток 10,11 или бактериями, 12–14 а также модели вирусных инфекций. 15,16 Развитие таких методов применительно к культурам кишечных органоидов значительно увеличило полезность этой модельной системы для самых разных целей.В то время как большая часть первоначальной основы для системы культивирования органоидов изначально возникла из глубоких корней в биологии развития, система моделей созревания теперь применяется в самых разных областях исследований, включая открытие новых лекарств и скрининг лекарств для конкретных пациентов, рак и иммунологию. исследования и патогенез инфекционных агентов. Число исследователей, применяющих системы культивирования кишечных органоидов для обогащения своих конкретных исследовательских программ, быстро растет как в фундаментальных исследованиях, так и в медицинском сообществе.

Эпителий кишечника

Кишечный эпителий включает несколько различных популяций клеток, включая быстро делящиеся кишечные стволовые клетки (ISC), которые облегчают типичный четырех-пятидневный цикл обновления кишечного эпителия взрослых. 17 Это свойство быстрой регенерации при кишечном застое делает кишечник уникально удобной модельной системой для биологии эпителиальных клеток и биологии взрослых стволовых клеток как внутри, так и за пределами специфического контекста функции кишечника.

Эпителий кишечника взрослого человека в основном состоит из шести типов клеток, которые расположены в структуре крипта-ворсинка 18 (Рисунок 1). В основании кишечной крипты ISCs обнаруживаются интеркалированными с клетками Панета, 17 , которым приписывают большую часть передачи сигналов, необходимых для поддержания ниши ISC. Транзитные амплифицирующие клетки представляют собой частично дифференцированные клетки, которые мигрируют вверх посредством физического механизма исключения крипт, когда ISC под ними делятся.По мере того как эти клетки движутся вверх из крипты, они перемещаются по сигнальным градиентам, которые запускают их дифференцировку, давая начало зрелым типам клеток, которые населяют домен ворсинок. Зрелые клетки включают энтероциты, которые составляют большую часть эпителия ворсинок и осуществляют всасывание питательных веществ; бокаловидные клетки, которые выделяют слизь для защиты эпителиальной выстилки и помогают перемещать кишечное содержимое через просвет; и энтероэндокринные клетки, которые реагируют на химические механизмы содержимого просвета, секретируя гормоны в организм для поддержания метаболизма питательных веществ.

Рис. 1. Схема эпителия тонкой кишки, подчеркивающая идентичность и пространственное расположение ключевых типов эпителиальных клеток.

Стволовые клетки LGR5 + сохраняют свою способность к самообновлению и регенерации кишечного эпителия в первую очередь благодаря своему положению в нише стволовых клеток. 2 Кишечная ниша хорошо охарактеризована и, как было показано, состоит из пространственных градиентов высокого WNT и фактора роста эпителия (EGF), тогда как сигналы костного морфогенетического белка (BMP) подавлены.Понимание этих ниш сигнализирует о развитии условий культивирования органоидов кишечника.

Типы органоидов кишечника

Органоиды, полученные из первичных тканей кишечника

Основополагающая работа по системе культивирования органоидов кишечника, вышедшая из лаборатории Ганса Клеверса в 2009 г. -1 , описывает систему культивирования, в которой ниша стволовых клеток взрослых кишечных стволовых клеток воспроизводится in vitro.Это позволяет создать органотипические культуры эпителиальных клеток кишечника, которые поддерживают регенеративные свойства кишечника in vivo. Эти кишечные органоиды, иногда называемые энтероидами, размножаются из эпителиальных кишечных стволовых клеток, которые существуют во взрослой кишечной ткани, и как таковые образуют изолированную эпителиальную структуру в культуре. Эта модель позволяет исследовать эпителиальную систему кишечника и напрямую манипулировать передачей сигналов ниши стволовых клеток без мешающего влияния ассоциированной мезенхимы.

Первый протокол, опубликованный Sato et al. –1 описали выделение интактных кишечных крипт из кишечной ткани мыши и их последующее культивирование с образованием органоидов. Кишечные крипты встроены в купол внеклеточного матрикса Matrigel ® и погружены в питательную среду, содержащую специфические факторы роста, предназначенные для имитации передачи сигналов, присутствующих в основании кишечных крипт in vivo. Эта работа продемонстрировала, что создание кишечных органоидов возможно из отдельных отсортированных LGR5 + кишечных стволовых клеток, полученных в результате диссоциации кишечных крипт. 1 При культивировании с использованием этого метода органоиды образуют эпителиальный монослой, окружающий центральный просвет, а также зарождающиеся домены крипт, которые, как сообщается, содержат кишечные стволовые клетки и клетки Панета, составляющие их нишу. Как и в кишечном эпителии in vivo, клетки, составляющие органоидный эпителий, вытесняются и отслаиваются в просвет органоида. Это приводит к сбору клеточного мусора в просвете со временем и связанному с этим снижению жизнеспособности культур даже в присутствии соответствующих факторов роста.Поэтому органоидные культуры периодически пассируют, отделяя органоиды от Matrigel ® и разбивая их на фрагменты, которые пересеивают в новые культуры. Этот процесс может повторяться бесконечно с замечательной генетической стабильностью, 19 , и представляет собой эффективный метод размножения популяции кишечных стволовых клеток.

После создания этой системы культивирования для тонкого кишечника мышей она была адаптирована для создания органоидов из тонкой кишки человека, крипт толстой кишки человека и мыши и отдельных стволовых клеток кишечника. 2,20 Хотя органоиды, полученные из крипт кишечника и толстой кишки, имеют много общих характеристик, они также обнаруживают значительные различия. Они отражаются в клеточной динамике тканей in vivo, а также в ответе тканеспецифичных взрослых стволовых клеток на специфические концентрации сигнала ниши, присутствующие в среде для культивирования клеток. Как правило, в то время как культуры органоидов тонкого кишечника мышей имеют тенденцию обнаруживать обширное почкование криптоподобных доменов, органоиды толстой кишки, происходящие из крипт как мыши, так и человека, имеют тенденцию демонстрировать более кистоподобную морфологию со значительно менее выраженным почкованием или отсутствием почкования.Точно так же существует повышенная потребность в передаче сигналов WNT при культивировании органоидов человека по сравнению с мышами. 2 Это вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток и приводит к более кистозному фенотипу для культур органоидов кишечника человека по сравнению с соответствующими органоидами мыши.

Было много улучшений и модификаций базовой методологии культивирования, впервые разработанной для органоидов кишечного эпителия мышей и человека. Эти последующие исследования представили методологии для специальной адаптации системы культивирования для тканей пациентов, происходящих из опухоли, с различными зависимостями от факторов роста 21,22 ; выращивание органоидов в форматах, подходящих для скрининга соединений со средней и высокой пропускной способностью 23,24 ; и использование определенных систем внеклеточного матрикса, 25 среди других приспособлений для конкретных приложений.

Органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток

Вскоре после внедрения системы культивирования органоидов, полученных из стволовых клеток кишечника, была опубликована методология культивирования органоидов кишечника человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в которой использовалась большая часть той же методологии для 3D-культуры органоидов. 3 В отличие от органоидов кишечного эпителия, выращенных из изолированных крипт или LGR5 + кишечных стволовых клеток, кишечные органоиды, полученные из дифференцированных hPSC, включают мезенхимный компартмент, который способствует передаче сигналов ниш кишечных стволовых клеток, присутствующих в культурах. 18 Органоиды кишечника, полученные в результате направленной дифференцировки hPSCs, также обладают характеристиками, напоминающими долгосрочные процессы, происходящие во время нормального развития тканей; на ранних пассажах органоиды характеризуются отчетливо фетальным кишечным фенотипом, тогда как полное созревание кишечных эпителиальных клеток до сих пор возможно только при трансплантации органоидов в капсулы почек мыши. 26 Повторение развития кишечника в органоидной системе, полученной из hPSC, делает эту модель отличным инструментом in vitro для исследования этапов развития кишечника в экспериментальной системе, которой легко манипулировать. 18 Кроме того, эта система позволяет получать органоиды от отдельных пациентов без необходимости биопсии кишечника или толстой кишки, что делает ее полезным инструментом для исследования фенотипических свойств кишечного эпителия людей с широким спектром генетических характеристик.

Протокол создания кишечных органоидов из недифференцированных клеток включает дифференцировку hPSCs в дефинитивную энтодерму и инициирование спецификации средней / задней кишки в виде монослойной культуры посредством индукции судьбы кишечника в 3D-культуре в виде кишечных органоидов. 3 Интересно, что формирование 3D-культур происходит в этих культурах спонтанно в ходе направленной дифференцировки в заднюю кишку; сфероиды, демонстрирующие маркеры задней кишки, выходят из монослойных культур и могут быть легко выделены из супернатантов культур. Подобно органоидам первичного тканевого происхождения, частично дифференцированные сфероиды затем внедряются в купола Matrigel ® и инкубируются в среде для культивирования клеток, которая способствует их дифференцировке в кишечные клоны и последующему частичному созреванию. 3

Экспериментальные методы, применяемые к органоидным культурам

Широкое распространение и применение культур органоидов кишечника в различных областях в значительной степени связано с множеством экспериментальных инструментов и подходов, которым эти культуры поддаются. С момента внедрения базовой методологии культивирования органоидов было много достижений как в разработке, так и в проверке различных методов в системе моделей кишечных органоидов.

Генетическая манипуляция

Ключевой функцией кишечной органоидной системы является способность манипулировать генетической идентичностью клеток, составляющих культуру, особенно по сравнению с проблемами или невозможностью подобных манипуляций, выполняемых в моделях in vivo. Культурами кишечных органоидов можно манипулировать генетически с помощью различных средств, включая введение генетического материала через ретро-, адено- и лентивирусную инфекцию 27–29 или электропорацию, 30 , а также специфический сайт-направленный мутагенез с использованием CRISPR Техника редактирования гена Cas9. 31 После применения определенной техники генетической модификации культуры органоидов могут быть восстановлены клонально из одноклеточных суспензий отсортированных стволовых клеток 1,2 или целых диссоциированных органоидов, что позволяет изолировать желаемый генетический вариант для дальнейшего размножения в 3D культура. Для модели кишечника мышей это дает значительное преимущество по времени и энергии, необходимым для создания особой линии мышей с нокаутом. Для модели кишечника человека способность манипулировать генетическим составом клеток in vitro дает возможность осуществлять такой уровень контроля над генетическим составом модели, который в противном случае был бы невозможен с использованием традиционных методов первичной клеточной культуры или иммортализованных клеточных линий. .

В дополнение к их совместимости с прямой генетической манипуляцией in vitro, культуры органоидов также являются высокоинформативным способом изучения ранее существовавших нокаутных моделей для исследования механизмов конкретных клеточных процессов или патологий болезней.

Биобанки

Культуры кишечных органоидов обладают высокой проходимостью, сохраняя при этом замечательный уровень генетической и фенотипической стабильности. 32 Однако иногда бывает выгодно создать статическую библиотеку органоидных культур путем криоконсервации культур. Это особенно верно в контексте создания криоконсервированных библиотек органоидов, полученных от пациентов, которые сохраняют свойства исходной культуры и могут использоваться в таких приложениях, как доклинический скрининг эффективности лекарств. 23 Оттаявшие клетки обычно имеют короткий период восстановления (от одного до двух пассажей), в течение которого они демонстрируют сниженную скорость роста, а после этого они возобновляют динамику роста до замораживания.

Системы совместного выращивания

Возможность изучать взаимодействие эпителиальных клеток, образующих основу системы культивирования органоидов кишечника, с другими конкретными типами клеток, которые могут быть введены в систему культивирования, составляет еще одно существенное преимущество системы модельных органоидов. Выделение эпителия (или эпителия с ассоциированной мезенхимой в случае органоидов, происходящих от hPSC) от других систем организма в системе органоидной культуры представляет собой преимущество для экспериментальной специфичности, но также и ограничение в отношении исследования специфических взаимодействий между этим эпителием и другие аутологичные или чужеродные клетки.Этот вопрос решается путем постоянного развития новых систем совместного культивирования органоидов кишечника с различными другими типами клеток. Органоиды кишечника культивировали с иммунными клетками 10,11,33 путем введения неэпителиальных клеток во внеклеточный матрикс, поддерживающий культуру органоидов, таким образом повторяя взаимодействия, которые, как ожидается, будут иметь место на базолатеральной стороне эпителия. Функциональная кишечная нервная система также была создана посредством совместного культивирования органоидов, полученных из hPSC, и клеток нервного гребня, что позволило создать модель, позволяющую изучать нарушения моторики желудочно-кишечного тракта человека. 34 Точно так же живые бактерии были введены в просвет органоидных культур посредством микроинъекции для моделирования взаимодействий, которые происходят на апикальной стороне эпителия in vivo. 12–14 Органоиды также прошли валидацию в качестве модельных систем вирусной инфекции. 15,16

Аппликации органоидов кишечника

Клеточная биология

Корни системы органоидной культуры лежат в сообществе биологов развития.В то время как эта область исследований предоставила информацию о факторах, необходимых для разработки модельных систем органоидных культур, кишечные органоидные культуры теперь возвращают ценную информацию о траектории развития ткани, для моделирования которой они были разработаны. 35 Это особенно верно для кишечных органоидов, происходящих из hPSC, которые следуют общим путям развития кишечника во время своего становления 3 и поддерживают фенотип, подобный эмбриональному, в культуре органоидов. 36 Большая полезность органоидных культур в этом контексте отчасти заключается в легкости доступа к континууму временных точек развития, что резко контрастирует с тем, что в других случаях доступно в отношении человеческих образцов.

Возможно, наиболее очевидное применение культур органоидов кишечника - это in vitro модельная система кишечного эпителия. Поскольку обе эти культуры включают все типы эпителиальных клеток, присутствующих в ткани in vivo, и воспроизводят многие, если не большую часть динамики внутри- и внутриэпителиальных клеток, которые происходят in vivo, культуры органоидов кишечника представляют собой ценный экспериментальный инструмент для исследования эпителия кишечника. клеточная биология. Таким образом, эта модельная система in vitro недавно была использована для исследования регенерации кишечника, 37,38 ниши стволовых клеток кишечника, 39–44 воспаления кишечника, 9,45–48 частоты мутаций стволовых клеток кишечника 49 и функции терминально дифференцированных эпителиальных клеток кишечника (например,

.

Смотрите также

MAXCACHE: 0.84MB/0.00054 sec